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荧光定量技术通过特异性荧光染料与靶蛋白的结合反应实现定量，其灵敏度和选择性显著优于传统方法。博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计作为一款紧凑型检测设备，采用特异性荧光探针技术，可实现微量核酸与蛋白质的快速定量，其核心优势包括样品消耗量少、检测速度快及抗干扰能力强等特点。

一、 材料与方法

（一）实验材料

1、仪器：博清生物荧光计；对照荧光计；紫外分光光度计；电子天平；微量移液器。

2、试剂：荧光标记蛋白标准品（FITC-BSA，分子量66 kDa，纯度≥98%）；荧光标记蛋白检测试剂盒；BSA标准品；常见干扰物（NaCl、SDS、Triton X-100、游离FITC染料）。

3、耗材：低吸附离心管（1.5mL）；无菌无酶吸头（0.1~10μL、10~100μL、100~1000μL）；仪器配套比色皿。

（二）实验方法

1、标准曲线制备

精确称量FITC-BSA标准品，用PBS缓冲液（pH7.4）配制浓度为1mg/mL的储备液，梯度稀释为0.05、0.1、1、10、50、100、200ng/μL的标准系列溶液。按照博清生物荧光计检测试剂盒说明书，取1μL标准溶液与199μL工作液（染料与缓冲液按1:200比例混合）充分混匀，室温避光孵育3分钟后，插入仪器检测仓进行荧光信号读取。以标准品浓度为横坐标，相对荧光单位（RFU）为纵坐标，采用二次曲线拟合建立标准曲线，计算回归方程及相关系数（R²）。

2、方法学验证

线性范围与检出限：对0.05~200ng/μL的FITC-BSA标准系列进行检测，每个浓度设置6个平行样，以R²≥0.995的浓度范围为有效线性范围；以3倍空白信号标准差（3SD）对应的浓度为检出限（LOD），10倍空白信号标准差（10SD）对应的浓度为定量限（LOQ）。

精密度：选取低（1ng/μL）、中（50ng/μL）、高（150ng/μL）三个浓度的FITC-BSA样品，每个浓度设置8个平行样，进行单次批内检测；连续5天进行批间检测，计算变异系数（CV）。

特异性与抗干扰性：在10ng/μL FITC-BSA样品中，分别加入不同浓度的干扰物，检测干扰物对定量结果的影响，以误差≤±5%为抗干扰合格标准。同时，对比博清生物荧光计与紫外分光光度计对含游离FITC的混合样品的检测结果。

3、实际样品检测

选取3组经荧光标记的目标蛋白（GFP融合蛋白、Cy3标记抗体、Alexa Fluor 647标记抗原），分别采用博清生物荧光计、对照荧光计及紫外分光光度计进行定量检测，每个样品设置3个平行样，比较三种方法的检测结果一致性。

二、结果与分析

（一）标准曲线与线性范围

博清生物荧光计对FITC-BSA的检测标准曲线呈现良好的二次拟合关系，回归方程为 y=0.032x²+5.87x+12.3（R²=0.9992），有效线性范围为0.1~200ng/μL，覆盖了大部分荧光标记蛋白实验的常用浓度区间。检出限（LOD）为0.05ng/μL，定量限（LOQ）为0.15ng/μL，显著低于传统紫外吸收法（LOD≈1 ng/μL），表明该仪器对低浓度荧光标记蛋白具有更高的检测灵敏度。

（二）精密度验证

批内与批间精密度结果显示，低、中、高三个浓度样品的批内CV分别为1.8%、1.2%、0.9%，批间CV分别为2.9%、2.1%、1.7%，均低于5%的行业标准，表明该方法的重复性良好，检测结果稳定可靠。

（三）特异性与抗干扰性

抗干扰实验结果表明，当NaCl浓度≤300mmol/L、SDS浓度≤0.5%、Triton X-100浓度≤2%时，博清生物荧光计的检测结果误差均≤±3.5%，且对游离FITC染料（≤5μg/mL）无明显响应，而紫外分光光度计在含0.5μg/mL 游离FITC的样品中检测误差高达28.7%。这一结果证实，博清生物荧光计通过特异性荧光染料与蛋白质的结合反应，可有效排除游离染料及常见污染物的干扰，检测特异性显著优于紫外吸收法。

（四）实际样品检测对比

对3组实际荧光标记蛋白样品的检测结果显示，博清生物荧光计与对照荧光计的检测值无统计学差异（P>0.05），而紫外分光光度计的检测值普遍偏高（误差12.3%~27.5%），主要原因是其无法区分蛋白结合荧光与游离荧光。此外，博清生物荧光计的单次检测时间仅需3~5分钟，样品消耗量仅1μL，较对照系统（样品量2μL，检测时间5~8分钟）更具高效性和经济性。

三、讨论

荧光标记蛋白的定量分析面临两大核心挑战：低浓度样品的精准检测与复杂基质中的特异性识别。本研究建立的博清生物荧光计检测方法，通过以下技术优势解决了上述问题：其一，采用高特异性荧光染料，仅与蛋白质结合后发射荧光信号，有效排除游离染料、盐离子及去污剂等干扰，这与对照系统的检测原理一致，但在抗干扰浓度阈值上更具优势（如耐受2% Triton X-100，高于对照系统的1%）；其二，仪器光学系统的高灵敏度设计使检出限低至0.05ng/μL，满足了微量珍贵样品（如免疫沉淀产物、活体组织提取蛋白）的定量需求；其三，简化的操作流程（无需复杂样品预处理，孵育时间≤3分钟）及低样品消耗量（1~20μL），显著提升了实验效率并降低了成本。

在实际应用中，标准曲线的制备质量是影响荧光定量准确性的关键因素。本研究通过严格控制试剂新鲜度、同批次处理标准品与样品、确保R²≥0.998等措施，有效降低了系统误差。此外，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计的紧凑型设计使其适用于移动实验室或现场检测场景，而其兼容多种荧光标记（FITC、Cy3、Alexa Fluor 系列等）的特性，进一步拓展了应用范围。

与现有技术相比，本方法的局限性在于对高浓度样品（>200ng/μL）需进行稀释处理，且检测结果依赖于专用试剂盒的特异性。未来可通过优化染料配方与仪器光学参数，进一步拓宽线性范围，并开发针对不同修饰类型荧光标记蛋白的专用检测模块，以满足更复杂的实验需求。

本研究成功建立了基于博清生物荧光计的荧光标记蛋白定量分析方法，该方法具有线性范围宽（0.1~200ng/μL）、检出限低（0.05ng/μL）、精密度高（CV<3.1%）及特异性强等优点，可有效排除游离荧光染料及常见污染物的干扰。与传统紫外吸收法及商用荧光定量系统相比，博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光计在检测效率、样品消耗量及抗干扰能力上更具优势，适用于蛋白质组学研究、生物制药质量控制、临床诊断等多个领域。该方法的建立为荧光标记蛋白的精准定量提供了新的技术选择，具有重要的科研价值与应用前景。